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液相色譜法是20世紀60年代末在經(jīng)典液相色譜的基礎上發(fā)展起來(lái)的一種現代色譜分析方法,歷*曾出現過(guò)不同的叫法,如,高壓液相色譜(HPLC)、高速液相色譜(HSLC)和高分辨液相色譜(HRLC)。就分離原理而言,HPLC與經(jīng)典柱層析(色譜)沒(méi)有本質(zhì)的區別,但由于采用了高壓輸液泵、微粒固定相和高靈敏度檢測器,HPLC在分析速度、分離效率、檢測靈敏度和操作自動(dòng)化方面,都達到了可與GC相比的程度,并保持了樣品適用范圍廣、流動(dòng)相種類(lèi)多和便于制備的柱層析優(yōu)點(diǎn),在生物工程、制藥工業(yè)、食品工業(yè)、環(huán)境監測和石油化工等領(lǐng)域獲得了廣泛的應用!
HPLC的特點(diǎn):
①樣品適用范圍廣;
②分離效率高;
③檢測靈敏度高;
④分析速度快;
⑤樣品回收方便;
液相色譜法的分類(lèi):
HPLC的分類(lèi)方法有多種,比較常見(jiàn)的有三種:
(1)按照分離機理分類(lèi):
①吸附色譜
②分配色譜
③離子交換色譜(IEC)
④體積排阻色譜(SEC)
⑤親和色譜(AC)
(2)按照色譜柱洗脫動(dòng)力學(xué)分類(lèi):
①洗脫法
②前沿法
③置換法
(3) 按照分離目的分類(lèi):
①分析液相色譜
②制備液相色譜
HPLC分析常用的樣品處理技術(shù):
粉碎、冷凍干燥、氣體萃?。斂辗治龊痛祾?捕集)、溶劑萃?。ɑ亓骰蛩魇陷腿?,加壓溶劑萃?。?、固相萃取、固相微萃取、超臨界流體萃取、微波萃取、超聲波萃取、微透析、衍生化、膜分離、蒸餾、吸附、離心、過(guò)濾、濃縮和溶解等。
色譜定性分析方法
標準物質(zhì)對照定性;
利用文獻數據定性;
利用選擇性檢測器定性;
在線(xiàn)聯(lián)用儀器定性;
其它定性方法;
液相色譜儀使用及維護方法
液相色譜儀使用時(shí)要非常注意!
使用卡套柱時(shí),兩端的卡套應時(shí)刻連接在柱芯上。不管您是平衡色譜柱或是清洗,任何時(shí)候都不能將卡套取下來(lái),否則會(huì )造成填料的流失。
液相色譜柱使用注意:
卡套柱的安裝(加預柱):
將卡套架套入柱芯
將兩片夾套片嵌入柱芯的凹槽,使夾套高于柱芯
將已套到柱芯上的卡套架向上推,直至高過(guò)夾套片
將“子彈頭”預柱放入卡套片內
將卡套帽和卡套架旋在一起,然后用手擰緊
然后依同樣的順序連接好柱子的另一端
平衡色譜柱
反相色譜柱在經(jīng)過(guò)出廠(chǎng)測試后是保存在乙腈/水中的。請一定確保您所使用的流動(dòng)相和乙腈/水互溶。由于色譜柱在儲存或運輸過(guò)程中可能會(huì )干掉,因此在用流動(dòng)相分析樣品之前,應使用10~20倍柱體積的甲醇或乙腈平衡色譜柱;如果您所使用的流動(dòng)相中含有緩沖鹽,應注意用純水“過(guò)渡”。
硅膠柱或極性色譜柱在經(jīng)過(guò)出廠(chǎng)測試后是保存在正庚烷中的。如果該色譜柱需要使用含水的流動(dòng)相,請在使用流動(dòng)相之前用乙醇或異丙醇平衡
如何平衡色譜柱?
平衡過(guò)程中,將流速緩慢地提高用流動(dòng)相平衡色譜柱直到獲得穩定的基線(xiàn)(緩沖鹽或離子對試劑度如果較低,則需要較長(cháng)的時(shí)間來(lái)平衡)
色譜柱的再生
進(jìn)行色譜柱再生時(shí),應使用一個(gè)廉價(jià)的泵,我們建議不使用您的液相色譜儀上的泵。
注意:
在對NH2改性的色譜柱進(jìn)行再生時(shí),由于NH2可能成銨根離子的形式存在,因此,應該在水洗后用0.1M的氨水沖洗,然后再用水沖洗至堿溶液*流出。如果簡(jiǎn)單的有機溶劑/水的處理不能夠*洗去硅膠表面吸附的雜質(zhì),用0.05M稀硫酸沖洗非常有效。
液相色譜的常用術(shù)語(yǔ)
1.色譜曲線(xiàn)(chromatogram):
在色譜法中,當樣品加入后,樣品中各組分隨著(zhù)流動(dòng)相的不斷向前移動(dòng)而在兩相間反復進(jìn)行溶解、揮發(fā),或吸附、解吸的過(guò)程。如果各組分在固定相中的分配系數(表示溶解或吸附的能力)不同,就有可能達到分離。
分配系數小的組分滯留在固定相中的時(shí)間短,在柱內移動(dòng)的速度快,先流出柱子;分配系數大的組分滯留在固定相中的時(shí)間長(cháng),在柱內移動(dòng)的速度慢,后流出柱子;分離后的各組分經(jīng)檢測器轉換成電信號而記錄下來(lái),得到一條信號隨時(shí)間變化的曲線(xiàn),稱(chēng)為色譜流出曲線(xiàn)或 “色譜峰”,理想的色譜流出曲線(xiàn)應該是正態(tài)分布曲線(xiàn)。
2.(色譜)峰(chromatographic peak):
色譜柱流出組分通過(guò)檢測器系統時(shí)所產(chǎn)生的響應信號的微分曲線(xiàn)。
3.峰底(peak base):
峰的起點(diǎn)與終點(diǎn)之間的連接的直線(xiàn)。
4.峰高(h,peak height):
色譜峰zui大值點(diǎn)到峰底的距離。
5.峰寬(W ,peak width):
在峰兩側拐點(diǎn)處所作切線(xiàn)與峰底相交兩點(diǎn)的距離。
6.半高峰寬(Wh/2 ,peak with d at half height):
通過(guò)峰高的中點(diǎn)作平行于峰底的直線(xiàn),此直線(xiàn)與峰兩側相交兩點(diǎn)之間的距離(圖1 中的HJ)。
7.峰面積(A ,peak area):
峰與峰底之間的面積(圖1中的CHEJDC)。
8.拖尾峰(tailing peak):
后沿較前沿平緩的不對稱(chēng)的峰。
9.前伸峰(leading peak):
前沿較后沿平緩的不對稱(chēng)的峰。(又叫伸舌峰、前延峰)
10.假峰(ghost peak):
除組分正常產(chǎn)生的色譜峰外,由于儀器條件的變化等原因而在譜圖上出現的色譜峰,即并非由試樣所產(chǎn)生的峰。這種色譜峰并不代表具體某一組分,容易給定性、定量帶來(lái)誤差。(又叫鬼峰)
11.畸峰(distrorted peak):
形狀不對稱(chēng)的色譜峰,前伸峰、拖尾峰都屬于這類(lèi)。
12.反峰(negative peak):
也稱(chēng)倒峰、負峰,即出峰的方向與通常的方向相反的色譜峰。